Protein-Engineering mit reduziertem Risiko

REDUCE – das Akronym steht für die Technologie „Rational Enzyme Design using CRISPR Editing“. Dass man bei dem Akronym an „Reduktion“ denkt, ist gewollt, wenngleich die Technologie für das Unternehmen selbst eher ein Zugewinn ist: Denn mit der eigens entwickelten und in einigen Ländern auch schon als Handelsmarke eingetragenen Technologie hat die BRAIN AG ihr Biotechnologie-Portfolio erweitert und kann nun Proteine präzise verändern, ohne, dass nach deren Optimierung der Mikroorganismus (Wirtsorganismus) für die Produktion gewechselt werden muss. Damit kann der Aufwand für typische Protein-Engineering-Experimente drastisch reduziert werden. Ein Vorteil, den Enzymentwickler und -hersteller zu schätzen wissen.

Fehlentwicklungen bei der Enzymoptimierung vermeiden

Bei der Optimierung und Produktion von Enzymen spielt die Wahl eines geeigneten Produktionswirts, also der Mikroorganismenzelle, die später das veränderte Enzym produzieren soll, eine wesentliche Rolle. Die kostengünstige Herstellung eines spezialisierten Enzyms hängt maßgeblich vom Wirtsorganismus und seiner Funktion als Expressionssystem ab – und vom Erfolg des Protein-Engineerings.

Im Allgemeinen werden im Labor Protein-Engineering-Experimente mit Plasmid-basierten Expressionssystemen durchgeführt. Geht es vom Labor in die Produktion, muss der Wirt meist gewechselt werden, indem das zuvor modifizierte Gen isoliert und in das Genom des eigentlichen Produktionswirts integriert wird. Für die Enzymproduktion kann dieser zweistufige Vorgang jedoch von Nachteil sein, denn: Wirtsorganismen unterscheiden sich generell voneinander, z.B. durch ihre transkriptionellen und translationalen Kontrollelemente, durch ihre Genstruktur oder auch durch die Art, wie Proteine sezerniert oder gefaltet werden. Insbesondere posttranslationale Modifikationen, die Prozessierung von Molekülen und der Einbau von Cofaktoren können die Enzymeigenschaften dramatisch in eine unliebsame Richtung hin verändern. Daher empfehlen Experten Protein-Engineering-Experimente unbedingt direkt im ausgewählten Produktionsorganismus durchzuführen, um eine solche Fehlentwicklung und die damit möglichweise verbundenen negativen Effekte auf die Enzymoptimierung zu vermeiden bzw. so gering wie möglich zu halten.

Amylasen aus Hefezellen

Wissenschaftler bei BRAIN haben im Verlauf ihrer F&E-Aktivitäten zur Enzymoptimierung eine Technik entwickelt, mit der das Protein-Engineering direkt im Genom des ausgewählten Produktionsorganismus möglich ist. Dazu haben sie das „Rational Enzyme Design“ (Rationale Vorhersage von Aminosäureaustauschen) und CRISPR-Editing (gezieltes Schneiden der DNA) geschickt miteinander kombiniert – herausgekommen ist das „Rational Enzyme Design using CRISPR Editing“, also REDUCE.

„Versuchskaninchen“ für die Wissenschaftler waren zwei Alpha-Amylasen, Enzyme, die z.B. in der Bioethanol-Herstellung zum Einsatz kommen, wenn stärkehaltige Rohstoffe fermentiert werden. Um die Amylasen zu optimieren, entwarfen die Protein-Ingenieure bei BRAIN zusammen mit ihren Bioinformatik-Kollegen eine Amylase-Bibliothek. In ihrem Produktionsorganismus konnten sie darstellen, dass sich die Genschere CRISPR/Cas9 für die gezielte Genmanipulation von chromosomalen Genkopien eignet, um das gewünschte Protein zu modifizieren. Wirtsorganismus war übrigens Pichia pastoris, eine der „Lieblingshefen“ der Biotechnologen.

Mit der Methode REDUCE war es dem BRAIN-Team möglich spezifische Mutationen in Form von exakten Basenaustauschen in der DNA des Wirtsorganismus zu setzen. Beim anschließenden Enzym-Screening identifizierte das Team mehrere „Hits“ mit verbesserten Eigenschaften. In einem nächsten Schritt wurden die optimierten Amylasen biochemisch charakterisiert, so dass sie jetzt Enzym-Unternehmen als Entwicklungskandidaten zur Verfügung gestellt werden können.

Fazit

REDUCE kann das Risiko für Fehlentwicklungen bei klassischen Protein-Engineering-Experimenten drastisch reduzieren. Die Technologie ersetzt das plasmidbasierte Screening zur Identifizierung von Hit-Mutanten vor der Integration in den designierten Produktionsstamm. Es entfällt die Notwendigkeit zur Validierung der vorteilbringenden Mutationen, wenn sie dann in dem im genomischen Kontext des final für die Produktion ausgewählten Organismenstamm produziert werden. So trägt REDUCE dazu bei, dass BRAIN bei der Enzym-Entwicklung für seine Kunden zu raschen Ergebnissen kommt. Daher: Protein-Engineering mit reduziertem Risiko – auch für unsere Kunden.